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Los tintes fluorescentes de diferentes colores en una preparación se incorporan uno tras otro y se pueden superponer entre sí en el ordenador. A los tintes respectivos se les puede asignar cualquier color, opcionalmente su color natural u otro, este último por ejemplo para contrastar mejor los colores.

Sin embargo, a menudo son difíciles de estimular mediante el uso convencional con luz ultravioleta. Alrededor de 1962, Ploem inició una colaboración con Schott-Werke en Mainz para desarrollar divisores de haz dicroicos que reflejaran la luz azul o verde. Schott había fabricado anteriormente muchos de los filtros de vidrio que se utilizan comúnmente en microscopía de fluorescencia. La empresa Leitz suministró a Ploem una luz incidente opaca con un espejo semitransparente independiente del color. Por primera vez, la excitación llegó a través de la lente, como es habitual en la actualidad.

Un tinte fluorescente también puede excitarse por absorción de dos fotones en lugar de por absorción de un fotón. La densidad de fotones es entonces tan alta que existe una probabilidad suficiente de que dos fotones lleguen a la molécula fluorescente al mismo tiempo. A diferencia de la microscopía confocal, donde el volumen de lectura es limitado, el volumen de excitación está limitado aquí. La luz de onda más larga penetra en los tejidos biológicos en mayor medida, ya que éstos la absorben con menor intensidad y también se dispersan con menor intensidad. Por tanto, la microscopía de fluorescencia de dos fotones se utiliza para penetrar más profundamente en el tejido de lo que es posible con otros métodos.

Confocales y dos

Los láseres pulsados ​​y modulados están disponibles en el rango de longitud de onda visible para excitación con un fotón. FLIM también se puede usar en combinación con excitación de fotones múltiples, para lo cual se requieren láseres pulsados ​​de todos modos. Con esto, se completó en principio el desarrollo del microscopio de epifluorescencia, tal como se sigue utilizando en la actualidad.

Sin embargo, necesitó hasta 20 minutos de tiempo de exposición para sus fotografías. Para aumentos bajos, menciona tiempos de exposición con lámparas de arco de carbón de uno a diez minutos. La solución de nitrosildimetilanilina en la cubeta del filtro de excitación podría reemplazarse por filtros de vidrio negro que contienen óxido de níquel.

En términos de funcionalidad, se hace una distinción entre filtros de paso corto, paso largo y paso de banda. Los filtros de paso corto dejan pasar la luz hasta una determinada longitud de onda. Un KP480 transmitiría luz hasta 480 nm y bloquearía la luz de longitudes de onda más largas. Por el contrario, los filtros de paso largo dejan pasar la luz de una determinada longitud de onda, es decir, una LP520, luz con longitudes de onda superiores a 520 nm. Los filtros de paso de banda solo permiten el paso de una determinada sección del espectro.

Estado del artículo

Si bien la película fotográfica se utilizó anteriormente, tuvo lugar a fines del siglo XX. Las cámaras CCD se utilizan a menudo para tomar imágenes en blanco y negro.

1972: Johan Sebastiaan Ploem y la introducción de los filtros de interferencia

Sin embargo, iban a pasar varios años antes de que este tipo de construcción fuera generalmente aceptado. También se mencionó la posibilidad de poder detectar fluorocromos como FITC y rodamina uno tras otro reemplazando todos los filtros. Haitinger trabajó en estrecha colaboración con la empresa Reichert para mejorar su microscopio de fluorescencia. Este también tenía una lámpara de arco con electrodos de hierro como fuente de luz, ya que tenía un componente UV comparativamente alto entre 300 nm y 400 nm.

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